為了實(shí)現(xiàn)ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化，顯色最好在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯(cuò)的一個(gè)方法，但要注意相應(yīng)的縮短顯色時(shí)間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。為了提高ELISPOT檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，增加實(shí)驗(yàn)的可信度，必須建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范不僅僅是一些實(shí)驗(yàn)操作，更是一個(gè)系統(tǒng)工程，需要提升到實(shí)驗(yàn)室管理與制度架構(gòu)上來(lái)建設(shè)。這包括實(shí)驗(yàn)室制度的建立，實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)程序的建立和標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試劑、耗材的選擇與標(biāo)準(zhǔn)化等等。單就實(shí)驗(yàn)流程而言，標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范從實(shí)驗(yàn)樣品的采集階段就開(kāi)始了，一直延續(xù)到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)束，即數(shù)據(jù)分析處理的完成。參見(jiàn)圖1。

如右圖所示，影響到ELISPOT斑點(diǎn)頻率的因素很多，我們來(lái)逐一分析。

細(xì)胞類型
通常我們用來(lái)做ELISPOT檢測(cè)的細(xì)胞有血液來(lái)源的PBMC和脾臟來(lái)源的淋巴細(xì)胞。也有的實(shí)驗(yàn)者需要用到骨髓細(xì)胞。來(lái)源不同，細(xì)胞的組成就有差別，所以要考慮到這些差別，不能直接作比較。是哪些因素導(dǎo)致了細(xì)胞來(lái)源不同，ELISPOT結(jié)果就不同呢？

一個(gè)因素是陽(yáng)性細(xì)胞在生物體內(nèi)的分布。我們知道，細(xì)胞免疫往往發(fā)生在局部的免疫反應(yīng)部位。比如發(fā)生粘膜免疫時(shí)，各種免疫細(xì)胞就會(huì)富集在粘膜器官；發(fā)生自身免疫反應(yīng)時(shí)，致敏細(xì)胞也往往集中在受累器官。所以，局部器官的淋巴細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例與血液或者脾臟中陽(yáng)性細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例可能是不相同的。血液與脾臟之間也可能有差別。

另一個(gè)因素是APC的含量。不同組織器官來(lái)源，甚至不同的分離方法，在淋巴細(xì)胞中混合的APC細(xì)胞含量也有差異。極端情況（比如待測(cè)細(xì)胞是經(jīng)過(guò)磁珠純化的）APC含量不足，需要添加APC（人工培養(yǎng)的DC細(xì)胞或者“飼養(yǎng)細(xì)胞”）。這方面的詳細(xì)情況參見(jiàn)第四節(jié)。 
所以，標(biāo)準(zhǔn)化必須考慮細(xì)胞類型和細(xì)胞組成。

細(xì)胞狀態(tài)
細(xì)胞狀態(tài)是體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)水平與經(jīng)驗(yàn)實(shí)力的試金石。很多實(shí)驗(yàn)者問(wèn)我，為什么有些人的ELISPOT結(jié)果做得非常好，而另外有些人的結(jié)果卻做得非常糟。略去客觀因素不談，主觀因素主要體現(xiàn)在對(duì)檢測(cè)細(xì)胞的處理上。有些人有長(zhǎng)期養(yǎng)細(xì)胞和做細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，處理細(xì)胞來(lái)得心應(yīng)手，獲得的細(xì)胞狀態(tài)好，活力高，ELISPOT檢測(cè)的結(jié)果自然就好。反之，有些細(xì)胞還沒(méi)拿去做ELISPOT檢測(cè)之前，已經(jīng)被折騰得死去大半或者奄奄一息了，這樣能做出好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)嗎？！

細(xì)胞狀態(tài)涉及到細(xì)胞來(lái)源（包括組織取樣）、細(xì)胞分離的方法、以及細(xì)胞是否需要凍存復(fù)蘇等諸方面。關(guān)于保持良好細(xì)胞狀態(tài)的內(nèi)容參見(jiàn)第四節(jié)；關(guān)于細(xì)胞分離方法的內(nèi)容參見(jiàn)第六節(jié)；關(guān)于細(xì)胞凍存復(fù)蘇方面的內(nèi)容參見(jiàn)第七節(jié)。

這些環(huán)節(jié)都要做到標(biāo)準(zhǔn)化，細(xì)胞狀態(tài)才有保證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與可信度才有保證。

細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞計(jì)數(shù)看起來(lái)很簡(jiǎn)單，很多實(shí)驗(yàn)者都忽視它。但是它對(duì)ELISPOT結(jié)果可信度與重復(fù)性的影響是怎么強(qiáng)調(diào)也不過(guò)分的。因?yàn)镋LISPOT檢測(cè)的是細(xì)胞頻率，分子式斑點(diǎn)的數(shù)目，分母是細(xì)胞的數(shù)目。如果經(jīng)過(guò)千辛萬(wàn)苦，我們把分子（也就是斑點(diǎn)）弄得很漂亮，也弄得很準(zhǔn)確，但是分母卻給忽略了，那這個(gè)分?jǐn)?shù)值（陽(yáng)性細(xì)胞頻率）能準(zhǔn)確嗎？

我們達(dá)科為對(duì)此有刻骨銘心的感受。我們公司在05-06年曾經(jīng)有一個(gè)ELISPOT研究項(xiàng)目，就是研究相同的凍存細(xì)胞與刺激物在不同的實(shí)驗(yàn)室是否能做出相同的結(jié)果。我們下了很大的功夫去研究細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇，研究?jī)龃婕?xì)胞在國(guó)內(nèi)的長(zhǎng)途運(yùn)輸，也下了很大功夫去培訓(xùn)參與實(shí)驗(yàn)的各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的人員技術(shù)與資質(zhì)。最后做出來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果單從斑點(diǎn)與背景上來(lái)看無(wú)可挑剔，但是有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)與其它八個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)有較大差異。最后經(jīng)過(guò)詳細(xì)的排查，原因竟然出現(xiàn)在血球計(jì)數(shù)板上！這兩家實(shí)驗(yàn)室的血球計(jì)數(shù)板質(zhì)量差，誤差大，導(dǎo)致最后細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差竟然達(dá)到±40%！

細(xì)胞計(jì)數(shù)最常見(jiàn)的裝備是血球計(jì)數(shù)板，雖看看起來(lái)不是什么高、精、尖設(shè)備，但是也代表了一個(gè)國(guó)家玻璃精加工的水平。我國(guó)能夠研制精密的大功率固體激光器，也有水平做出高質(zhì)量的血球計(jì)數(shù)板。可惜的是有能力不一定有愿望，目前國(guó)產(chǎn)的各種血球其數(shù)板經(jīng)過(guò)測(cè)試都存在較大的誤差。建議還是購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口的血球計(jì)數(shù)板，確實(shí)好用。如果一定要用國(guó)產(chǎn)的，那請(qǐng)堅(jiān)持使用同一塊血球計(jì)數(shù)板。

細(xì)胞稀釋也必須認(rèn)真仔細(xì)，取樣之前注意混勻。做重要實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，最好讓兩個(gè)人獨(dú)立稀釋和計(jì)數(shù)，結(jié)果相差要控制到10%以內(nèi)。

刺激物、試劑盒與血清
實(shí)驗(yàn)要取得重復(fù)性，刺激物的刺激效果必須要可重復(fù)、可再現(xiàn)。一批刺激物用完之后，換下一批刺激物的時(shí)候，要做驗(yàn)證性試驗(yàn)。另外，有些多肽、蛋白類的刺激物可能在保存的過(guò)程中會(huì)失活、降解，反復(fù)凍融也會(huì)造成問(wèn)題。這就要求預(yù)先擬定好刺激物的保存計(jì)劃，時(shí)隔三個(gè)月或者半年就要做一次驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)。相關(guān)內(nèi)容參見(jiàn)第四節(jié)。

目前市場(chǎng)上的ELISPOT試劑盒都是來(lái)自國(guó)際知名的公司，不同公司的試劑盒采用的抗體質(zhì)量都是有保證的。但是大家往往忽略了抗體之外的其他成分，比如封閉液、抗體稀釋液等等。這些也輔助試劑會(huì)造成顯著的差別。在追求實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與可信度的時(shí)候，必須引起重視。

血清與內(nèi)毒素當(dāng)然是一個(gè)重要影響因素，為了實(shí)現(xiàn)ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化，提高實(shí)驗(yàn)的可信度與重復(fù)性，根本之道是采用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)。相關(guān)內(nèi)容參見(jiàn)第三節(jié)和第五節(jié)。

實(shí)驗(yàn)操作流程與斑點(diǎn)顯色
本手冊(cè)的第三節(jié)就是ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，只要遵照?qǐng)?zhí)行，應(yīng)該沒(méi)有什么問(wèn)題。但是有一點(diǎn)需要引起重視，那就是標(biāo)準(zhǔn)化同時(shí)也是固定化。往往一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作步驟有很大的彈性空間，可以這樣做也可以那樣做。如果較真起來(lái)，這些做法都有像它的道理，理論與實(shí)驗(yàn)也不能證明誰(shuí)比誰(shuí)更優(yōu)。這才是他們得以同時(shí)保留下來(lái)的原因。但是一旦實(shí)驗(yàn)室的操作方法固定下來(lái)，就不要隨意更改，即便是“等效”的操作也不要隨意變化。標(biāo)準(zhǔn)化其實(shí)也是固定化。只要標(biāo)準(zhǔn)操作方案沒(méi)有錯(cuò)誤，就要嚴(yán)格執(zhí)行。

斑點(diǎn)顯色之所以從實(shí)驗(yàn)流程中單列出來(lái)，是因?yàn)樗闹匾?。目前ELISPOT有三套顯色系統(tǒng)，一套是PVDF膜上的HRP/AEC顯色系統(tǒng)，顯紅色的斑點(diǎn)；一套是PVDF膜上的AP/BCIP·NBT顯色系統(tǒng)，顯藍(lán)色的斑點(diǎn)；一套是透明板上的GABA/銀染系統(tǒng)，顯黑色的斑點(diǎn)。應(yīng)該說(shuō)這些顯色系統(tǒng)之間的靈敏度與背景控制都沒(méi)有顯著的差別，但是一旦選定一種顯色系統(tǒng)之后，最好長(zhǎng)期堅(jiān)持，以滿足標(biāo)準(zhǔn)化的需要。 
顯色問(wèn)題除了顯色系統(tǒng)的選擇之外，還要注意顯色溫度與顯色時(shí)間。顯色是所有ELISPOT操作中唯一在“室溫”完成的操作步驟。但是，請(qǐng)注意生物學(xué)與化中的“室溫”是有嚴(yán)格所指的25°C±5°C，而不是籠而統(tǒng)之的所謂“室內(nèi)溫度”。進(jìn)入秋冬季以來(lái)，我們接到大量客戶電話，說(shuō)ELISPOT斑點(diǎn)顏色淺，懷疑是不是抗體失活。有意思的是，這些客戶多數(shù)集中在長(zhǎng)江流域。經(jīng)過(guò)仔細(xì)核實(shí)，他們的問(wèn)題幾乎都是由于冬季室內(nèi)沒(méi)有暖氣，室溫過(guò)低導(dǎo)致的顯色不足。特別注意：一旦顯色進(jìn)行了10分鐘以上，再提高溫度就沒(méi)什么意義了，因?yàn)槊敢呀?jīng)大部分失活。

為了實(shí)現(xiàn)ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化，顯色最好在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯(cuò)的一個(gè)方法，但要注意相應(yīng)的縮短顯色時(shí)間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。

斑點(diǎn)計(jì)數(shù)與數(shù)據(jù)處理
什么樣的點(diǎn)判定為ELISPOT有效斑點(diǎn)，什么樣的點(diǎn)不判定或者盤(pán)點(diǎn)為無(wú)效點(diǎn)，這就是斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的“尺度”。為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，必須統(tǒng)一“尺度”，不能搞“雙重標(biāo)準(zhǔn)”。統(tǒng)一尺度的前提是采用機(jī)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。例如在BioReader4000上，我們一共有十多項(xiàng)獨(dú)立的參數(shù)，用來(lái)描述和判定斑點(diǎn)。這些參數(shù)可以單獨(dú)保存為“方法文件”。只要“方法文件”中的參數(shù)相同，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)的“尺度”也就相同，標(biāo)準(zhǔn)化的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)就有保障。

數(shù)據(jù)處理，包括數(shù)據(jù)綜合，陰陽(yáng)性判斷，數(shù)理統(tǒng)計(jì)等等。不論怎么處理，應(yīng)該采取相同的處理方法，這沒(méi)有疑問(wèn)。

綜上所述，ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)化的思想就是：在ELISPOT實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)環(huán)節(jié)都采用切實(shí)有效的步驟和方法，并且固定下來(lái)，從而最終保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與可信度。