提高BAC，F(xiàn)osmid文庫(kù)拷貝數(shù)，您只差了一支誘導(dǎo)劑
還在糾結(jié)“單拷貝克隆產(chǎn)量低，高拷貝克隆穩(wěn)定性差”這個(gè)問(wèn)題嗎？現(xiàn)在只需一支誘導(dǎo)劑就可人為控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)啦！
首先安利一下Epicentre的專利技術(shù)——CopyControl?克隆系統(tǒng)，能夠讓您共享單拷貝和高拷貝的優(yōu)點(diǎn)。CopyControl?克?。菏紫纫詥慰截愋问缴L(zhǎng)，單拷貝可以確保插入穩(wěn)定及成功克隆編碼基因序列；在需要的時(shí)候，通過(guò)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成高拷貝克隆，以便下游應(yīng)用所需。這一系統(tǒng)可以用來(lái)構(gòu)建PCR克隆，對(duì)于BAC，F(xiàn)osmid文庫(kù)等大型質(zhì)粒格外有用。
CopyControl?克隆系統(tǒng)有兩個(gè)重要成分，相輔相成，缺一不可：
1．CopyControl? pCC1和pCC2載體
pCC1和pCC2載體含有兩個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)：?jiǎn)慰截惖拇竽c桿菌F-因子復(fù)制子和誘導(dǎo)型的高拷貝oriV。其中OriV的啟動(dòng)，需要trfA基因產(chǎn)物，由CopyControl?的另一個(gè)重要成分——TransforMax? EPI300 E.coli菌株提供。
圖1 pCC1載體圖譜
2．TransforMax? EPI300 E.coli
這是一種工程菌株，含有受誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制的trfA基因，在誘導(dǎo)的條件下可以提供啟動(dòng)oriV所需要的trfA基因產(chǎn)物。
圖2 TransforMax? EPI300 E.coli菌株基因型
CopyControl?克隆誘導(dǎo)步驟
1、將目標(biāo)DNA片斷連接到已經(jīng)線性化、去磷酸化的CopyControl? pCC1 Vector上。
2、轉(zhuǎn)化TransforMax? EPI300 E.coli感受態(tài)細(xì)胞，涂皿，在氯霉素LB培養(yǎng)基上篩選。（在這種條件下，trfA基因的表達(dá)被抑制，克隆以單拷貝數(shù)量生長(zhǎng)。）
3、挑選單克隆，進(jìn)行培養(yǎng)。
4、加CopyControl? Induction solution到管中，誘導(dǎo)TransforMax? EPI300宿主細(xì)胞內(nèi)trfA基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)oriV，克隆由單拷貝轉(zhuǎn)化為高拷貝。
5、用常規(guī)方法從誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)分離DNA。
圖3 CopyControl?克隆流程
相關(guān)產(chǎn)品信息
美國(guó)Lucigen公司成立于1998年，提供各類用于分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)品，可以使研究者成功克隆較難克隆的基因，其在2016年收購(gòu)了Illumina旗下Epicentre產(chǎn)品線。目前產(chǎn)品類別主要包括：體外轉(zhuǎn)錄、基因克?。˙AC克隆試劑盒）、感受態(tài)細(xì)胞（TG1噬菌體文庫(kù)構(gòu)建感受態(tài)）、體外擴(kuò)增、轉(zhuǎn)座子突變、蛋白表達(dá)、文庫(kù)構(gòu)建等。
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